摘　要　讨论了以芯片毛细管电泳为基础的微分离技术的平台特征,特别强调了微分离技术在生命科学中的潜在应用,也对不同类型电泳技术研究方法的异同进行了比较。

　　一个时期以来,以芯片为平台的微全分析系统(μ-TAS,又称芯片实验室)迅速崛起[1]。微全分析系统包括进样、分离、检测,广义的还涉及到反应和输运。现阶段分离技术的主流是电泳,在一种类似于毛细管的多个微通道内实现的高通量的电泳。除此之外,已经开始介入的分离技术还有离心、分配、剪切等。

　　电泳是电介质中带电粒子在电场作用下以不同速度向电荷相反方向迁移的现象,利用这种现象对化学或生物化学组分进行分离分析的技术称之为电泳技术。毛细管电泳泛指在极细的毛细管内实现的一大类电泳技术[2]。十几年来毛细管电泳作为一种非常重要的分离分析技术已对生命科学的各个领域的发展起到了极其重要的作用[3]。96根阵列毛细管电泳的实用化大大加快了举世瞩目的人类基因组工程的进程,使之由原定的2005年提前到2000年基本完成。在今后一段时间,以高通量微通道电泳为主体分离技术的微全分析系统将成为现代分析技术的主流并“可能引起分析化学的一场革命”。

　　1　以芯片电泳为代表的微分离学的平台特征[4]

　　1·1　材料

　　芯片状平台决定了其在材质上较之毛细管电泳有更多的选择余地,可用于芯片的材料包括石英、玻璃、塑料和陶瓷等。不同的材料影响分离通道加工工艺,同时也影响分离通道中的电渗流,表面吸附,杂质种类和含量,因此涉及到不同的表面修饰。

　　1·2　尺寸

　　现有微全分析系统中的通道的尺寸通常为50μm宽,10μ深,底宽略小于顶宽,截面大体呈梯型,面积约为相应毛细管的1/4,长度为5~10cm,总体积较相应电泳毛细管小一个数量级左右。这样一种尺寸当然远大于载体分子的平均自由程,因此连续介质定理成立,连续性方程可用。但是由于尺寸细微,使影响传动、传热和传质各因素的相对重要性发生变化。其中至少包括(1)自由对流下惯性力与粘性力的比值以及自由对流与受迫对流的判

　　据(如雷诺数值等);(2)面体比增加,因此包括表面张力,粘性力,换热等在内的表面作用增强,其中表面换热的增加使传热现象应用于流动控制成为可能;(3)流动和传热的边缘效应、端部效应增强,三维效应不能忽略,传热强化。相应的,必须对流动、扩散、对流以及导热和对流换热、相关的其他传热等予以深入研究。

　　2　微全分析系统的分离对象

　　2·1　一般对象

　　已经认定,芯片电泳可以用于分离包括DNA、蛋白、糖和各种小分子在内的不同对象,并将会用于药物筛选、临床诊断、功能基因分析、细胞计数等领域。这一部分的功能和毛细管电泳基本重叠,但是芯片电泳潜在成本低、体积小、速度快、易于实现高通量。因此,为后基因组时代所做的各种关于毛细管电泳及其应用的一系列研究工作原则上均可移植,相关的积累可以沿用。仅以我们实验室为例,这种积累大体涉及到下述几个方面。

　　2·1·1　单核苷酸多态性及临床应用

　　详细考察了毛细管筛分电泳中不同筛分介质,同一筛分介质中不同浓度以及不同添加剂对DNA分离的影响,对以羟丙基甲基纤维素为基础的筛分介质进行研究,并予以改进和优化[5,6]。考察了甘露醇、葡萄糖等不同添加剂对筛分能力的影响,开发出一系列全新的、以甘露醇添加剂为特征,具有超低粘度和高分辨率的毛细管电泳无胶筛分介质,其中一种的粘度仅为常规筛分介质的10%,和水在同一数量级,对DNA分离的柱效高达1,800,000塔板数/米,有望在芯片毛细管电泳中得到广泛的使用,以克服后者由于微小尺寸所造成的尺寸效应带来的种种困难[7]。对原筛分原理中传统的交缠浓度学说等进行修正[8,9],以修正后的理论为指导,以自行研制的上述筛分介质为载体,对毛细管电泳在医学基因诊断的各个相关分支领域中的应用进行了较为系统的、有一定覆盖面的研究[10~13]。和协和医科大学合作研究的结果表明,所发展的毛细管电泳无胶筛分介质已能够较为普遍地应用于基因突变的检测和基因的家系连锁分析,代表性工作是苯丙酮尿症(PKU)。通过对所提取的核酸的聚合酶链反应扩增产物进行毛细管电泳分离检测,成功地完成了61例普查,6个家系分析和1例产前诊断[14]。最新的结果还包括,首次完成的对一个Ⅱ型牙本质生长不全三代家系中13个成员进行连锁分析,令人满意地完成了该病的短串联重复序列多态性标记GATA62A11等的多态性检测[15]。

　　由于肿瘤检验在临床检验中的特殊位置,以及毛细管电泳在这一领域能够起到的独特作用,作为上述单核苷酸多态性和基因诊断工作的合乎逻辑的延伸,先后对三类肿瘤标记物的毛细管电泳检测进行了较为深入的研究,它们分别是多胺[16]、喋啶[17]和唾液酸[18]。这三项工作分别证明了毛细管电泳同时检测体液中多种低含量小分子的特殊功能。

　　2·1·2　蛋白质分析

　　蛋白质组研究的典型做法是:用液相色谱收集蛋白,用二维电泳对蛋白作双向分离,把分离带刮下,酶解,再用毛细管电泳作肽图,然后通过毛细管电泳-质谱作肽序列测定并将所得的数据和已有数据库内的数据对照。要对细胞内的所有蛋白质作这样的测定是一项工作量不下于人类基因组工程的巨大工程,需要世界范围内朝野一致的努力。我们早期开展的一些局部工作包括:对抗乙肝抗体[19,20]、人血胃泌素[21]、脑垂体组织培养液中的蛋白质[22],以及干扰素[23]等进行分析,并进一步把这一方面的工作扩大到血液代制品[24]和包括水稻等植物在内的其它生物物种,做出了13种不同水稻种子的蛋白质谱图[25],不仅为编制水稻种子的数据库、指纹库作了很好的准备,也为介入人类蛋白质组工程积累了经验。

　　2·1·3　蛋白质和其它分子的相互作用

　　用不同的亲和毛细管电泳、手性毛细管电泳和其他电泳模式系统研究了蛋白质-单一大分子配体、蛋白质-单一小分子配体,以及蛋白质-一个以上小分子配体之间的相互作用,其中包括tRNA合成酶和tR-NA[26]、凝集素-糖[27]、血清蛋白-铁[28]、血清蛋白-血红素[29]、人血清白蛋白(HSA)-卟啉[30]以及人血清白蛋白-多元手性药物的相互作用[31,32]。在对后者的研究中,观察到了药物之间的顶替和协同作用,例如Verapamil和HSA结合时两个对映体有不同的立体选择性,当Ibuprofen加入这一体系时R-Verapamil被部分取代,而S-Verapamil则完全不被取代。另一方面在Bupivacaine和Verapamil之间则存在着明显的协同作用[33,34]。

　　我们注意到,在上述相互作用中作为配体一方的小分子很大一部分是药物,因此在研究相互作用的同时,特别强调了对药物,尤其是手性药物的拆分、分析。以国际上400余种尚未拆分的手性药物为目标,用10余种手性试剂对上百种不同的商用手性药物进行大规模的毛细管电泳拆分筛选,并用核磁共振、微量热法、神经网络、分子动力学模型等对拆分机制进行研究,编制了有实际应用价值的手性拆分数据库[35~51]。

　　目前我们实验室的平台转移的工作已经开始。在自行设计、研制的芯片毛细管电泳-激光诱导荧光装置上,初步实现了DNA片段[52]、氨基酸和糖类物质的分析以及手性化合物的拆分,显示出芯片毛细管电泳在生命科学上的发展潜力。

　　2·2　单分子[53]

　　芯片电泳技术正和快速发展的激光诱导荧光(LIF)、电子偶合器件(CCD)等技术相结合逼近人类认识的另一个重要极限:在单分子层面上对不同物质实行分离检测。将芯片电泳与单分子检测技术结合,不仅仅是提供一种在流动相中检测单分子的方法,更重要的是给单分子检测引入一种极其重要的分离手段,不但毛细管电泳的知识积累可以转移到单分子水平上重新认识,也使芯片电泳技术拥有更广阔的应用前景,尤其在生物学及医学领域。

　　迄今为止,传统意义上的分析化学所测量的实际上是大量分子的系综平均值,这种系综的统计结果已经不能满足对复杂而非均相的生物体系的分析要求。目前看来,用芯片电泳检测单分子,至少在下述几个方面具有优势:可以给出某一物理量在整个研究体系中的分布,因此保留大量个体信息;可以检测某些指定分子随时间的变化行为,具有真正意义上的实时性,而由系综平均得到的结果中大量分子实际上处于不同的时间状态;将会揭示个体行为和大量分子平均行为的差异,有利于发现新的实验现象,甚至因此建立新的理论。也就是说单分子分析与系综分析法相比具有更强的适用于非均相的生物体系的能力。

　　最大限度的降低背景噪音是单分子检测技术的重要手段之一。如何把检测区体积的减小与检测效率的提高这一矛盾解决好,是单分子检测实用化的关键技术之一。目前,从检测方法上来分主要有光子记数法和直接成像法两大类。光子记数是以光电倍增管(PMT)或雪崩二极管(APD)为检测器进行点检测。成像法则包括近场探针扫描显微镜法和宽场扫描显微镜法等。单分子芯片电泳在一些领域也已经开始得到应用,比如DNA测序[54]、蛋白质构象变化[55]、分子相互作用等[56]。

　　3　关于开展微全分析系统中微分离研究的几点看法

　　充分注意电泳、毛细管电泳、芯片电泳以及单分子芯片电泳这些概念在逻辑上的关系,明确各自的内涵和外延,以及后者相对于前者而言更大程度上的专一性。仔细区分其中的共性和个性,一般而言,共性的更易于移植,而个性的则应予以更多的关注。借助传递理论,从理论层面上比较微小尺寸效应对分离的影响;运用统计力学和量子力学研究系综分析和单分子分析的异同,重新审视经典的电泳理论中基于大量分子运动行为特征的统计平均所得到的概念、结论在单分子范畴中的合理性,并借助装置的高通量特征予以验证。

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　　本文作者：林炳承

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