引言

　　超声成像医疗诊断方法是通过检测体内组织超声回波信号而确诊病变的方法,操作简便、实时、无辐射、无损伤,在医疗上应用广泛。但在对微病变组织及深层组织造影时存在困难,超声造影剂是一类能够显著增强超声诊断信号的药剂,可使左右心室、肿瘤等其他难于造影的病灶明显显影,在超声诊断中起到越来越重要的作用[1]。微泡超声造影剂回波反射能力强,微泡的浓度和大小是影响微泡反射强度的两个重要因素。微泡的反射强度与其半径的6次方成正比,但过大微泡会引起微脉管栓塞,不能穿越肺部毛细血管,适宜的尺寸在1-10微米之间。本文通过计算机图像分析软件对采集得到微泡显微图像进行分析,得到了超声造影剂微泡尺寸分布及浓度。

　　1　仪器、试剂与材料

　　KS-1200超声功率仪(宁波科生仪器厂),XSP-10CA光学显微镜(带数码视频接口,上海光学仪器厂),血球计数器(上海市求精生化仪器有限公司),物镜测微尺(上海光学仪器厂), Image-ProPlus-5. 0. 2图像分析软件(美国Media cybernetics公司), photoshop 7. 0图像分析软件(美国Adobe公司), excel软件,计算机。

　　Tween80(CP,天津市河东区红岩试剂厂),span60(CP,中国医药集团上海化学试剂公司),蔗糖酯(CP,天津市登峰化学试剂厂),NaCl(AR,中国医药工业公司南通制药厂), pH值为7. 01的磷酸盐缓冲溶液(自制)。

　　2　方法

　　2. 1　微泡超声造影剂的制备

　　将膜材料按质量比Span: Tween:蔗糖酯=15:10: 9在磷酸盐缓冲溶液中80℃溶解后,置于KS-1200超声功率仪中进行声空化。所得微泡悬浮液置于分液漏斗中静置,除去下层清液,取中间层微泡部分[2]。

　　2. 2　图像采集

　　相同倍率及焦距条件下,采集超声造影剂微泡、测微尺、血球计数器的数码显微图像,计算机保存。

　　2. 3　Image-Pro Plus图像分析软件测定尺寸分布

　　Image-Pro Plus5.0.2运用与图像读取设备相联的绝对空间刻度校准,可确保测量结果的准确性,试验中以测微尺尺寸作为参照。将测微尺与超声造影剂的显微图像输入Image-Pro Plus中,选取尺寸测量标准工具,选择半径测量参数,对300个微泡及测微尺圆半径进行测试。之后,将微泡半径测量尺寸与测微尺半径测量尺寸进行对比(测微尺每小格实际尺寸是10vm),得微泡实际半径尺寸。采用excel软件进行处理得微泡直径尺寸分布图。

　　2. 4　Photoshop图像分析软件测定超声造影剂微泡的浓度

　　超声造影剂微泡大小在1-10vm之间,与红细胞、微生物体的大小相当,因此,可采用血球计数器对微泡浓度进行分析。将血球计数室和微泡造影剂的显微图像输入photoshop图像处理软件中,之后,将两显微图像进行合并,利用擦除工具擦除血球计数器的图像方格,显出微泡超声造影剂的图像,然后进行计数。利用血球计数器计数0. 1立方毫米的实际微粒个数计算公式得出微泡的浓度(个/mL): n个小方格中的总微÷粒数方格总数×400×微粒稀释倍数。

　　3　结果与讨论

　　3. 1　实验制得的微泡

　　所制得的超声造影剂微泡在室温下放置3天后,取1ml微泡20倍后,进行显微图像采集,放大倍数200倍,如下图(Fig 1)所示。由图1可看出,微泡呈球状,表面光滑,分散性较好。

　　3. 2　Image-Pro Plus5. 0. 2图像分析软件测定尺寸分布结果

　　图2、图3分别为Image-Pro Plus 5. 0. 2软件测量测微尺、微泡半径尺寸的测量界面图。图4为采用excel软件处理所得的微泡直径尺寸分布图。

　　由图4可观察出,微泡尺寸分布相对集中,所有微泡都小于10μm,大多数微泡尺寸分布在2. 10-3. 60μm之间。实验测定五次微泡直径尺寸分布,取五次微泡平均直径,计算相对标准偏差RSD%值,结果如表1所示:

　　由表1可知,五次测量结果相对标准偏差为1.8%,由此可见,采用Image-Pro Plus图像分析软件测定微泡尺寸分布具有良好的重现性。

　　3. 3　Photoshop测定超声造影剂微泡浓度结果

　　图5为photoshop软件合并血球计数器与微泡显微图片后的界面图像。图6为利用擦除工具擦除血球计数器方格后显露出微泡显微图像的photo-shop界面图像。

　　实验测定五次微泡浓度值(测试中,微泡稀释20倍,血球计数器取4个方格),取五次平均值,计算相对标准偏差RSD%值,结果如表2所示:

　　由表2可看出,五次微泡浓度测量值的相对标准偏差为4. 2%,由此可见,采用photoshop图像分析软件测定微泡浓度,其重现性良好。

　　4　结论

　　利用Image-Pro Plus 5. 0. 2图像分析软件,采用对比测量方法,可简洁、快速测出微米级微泡的尺寸分布。血球计数器结合photoshop图像处理软件,可测出微泡造影剂的浓度。采用本文介绍的测量方法,对造影剂微泡进行分析的重现性良好,可对超声造影剂微泡尺寸分布及浓度进行简便快速测定。

　　参考文献

　　[1]杜永峰.纳米包膜造影微泡:设计与实验[D].西安交通大学博士论文, 2003. 6

　　[2]杜永峰,万明习,王素品等.基于表面活性剂的纳米包膜微泡超声造影剂.化工学报, 2003, 54(6): 807-812.

　　作者简介:高彩霞(1980~),女,在读硕士研究生,应用化学专业。E-mai:l gaoxia 0071@ 163. com.

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